Hóa chất gây đột biến hoa Phong Lan - Hóa Chất Thí Nghiệm

Hóa chất gây đột biến hoa Phong Lan

Hits: 1903

Hoa lan rất được ưa chuộng và cũng rất đa dạng về chủng loại. Số lượng loài lan cao gấp 4 lần số lượng loài động vật có vú hay hơn 2 lần số lượng loài chim. Tuy nhiên, hoa Lan đột biến hiện nay lại rất được người chơi Lan ưa chuộng. Bài viết sẽ giới thiệu phương pháp sử dụng hóa chất & vật lý gây đột biến hoa lan Aerides crispa Lindl .

Gây đột biến in vitro và đặc điểm đột biến thông qua phân tích hình thái và kiểu gen ở hoa lan Aerides crispa Lindl.


Tham khảo các bài viết về nuôi cấy mô thực vật ở đây

Tham khảo (thuốc) hóa chất gây đột biến hiệu quả nhất 2 Amino purine

Tóm tắt: Kỹ thuật nhân giống đột biến kết hợp với nuôi cấy mô và phương pháp marker phân tử cung cấp một công cụ mạnh mẽ để cải thiện các cây phát triển chậm như hoa lan. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển quy trình cho các nghiên cứu đột biến in vitro ở một giống lan dược liệu của Western Ghats, Aerides crispa Lindl., thường được gọi là Curled Aerides. Các protocorm in vitro được nuôi cấy 60 ngày tuổi được xử lý với nồng độ thấp (0.025–0.030%) của colchicine, ethyl methane sulphonate (EMS), và liều chiếu xạ gamma thấp (1–4Gy), và 27 sự kết hợp cho kết quả hình thành nhiều búp chồi khỏe mạnh với tỉ lệ sống sót 40-60%. Sau 20-30 ngày xử lý liều cao hơn riêng lẻ hoặc kết hợp làm chết protocorm hoặc chồi mới hình thành. 2500 cây giống in vitro khỏe mạnh được sàng lọc những thay đổi về kiểu hình ở chồi và rễ do tác động gây đột biến. Tổng cộng, 206 cây giống in vitro của 52 dòng biến thể đã được xác định trên cơ sở hình dạng lá độc đáo, màu sắc, sọc trắng, độ dày, chiều dài và chiều rộng và chiều dài và độ dày của rễ. Những dòng biến thể này đã được nhân lên, được bố trí trong một vườn lan và được so sánh với đối chứng về sự biến đổi di truyền bằng cách sử dụng phương pháp Random Amplified Polymorphic DNA. Chỉ có 15 dòng đột biến gen khác biệt được xác định, biểu hiện sự chênh lệch về tốc độ tăng trưởng, hình dạng lá, chiều dài lá, chiều rộng, sự thay đổi diệp lục, mật độ khí khổng và/hoặc hàm lượng sắc tố.

Từ khóa: Colchicine, Ethyl methanesulfonate, Gamma radiation (bức xạ tia gamma), In vitro mutation (đột biến in vitro), Orchidarium, Protocorms, Western Ghats, hóa chất đột biến hoa Lan, hoa lan đột biến.

Hoa lan là một trong những tạo vật đẹp nhất trên Trái đất, bao gồm một nhóm thực vật độc đáo có giá trị chủ yếu cho mục đích trang trí, nhưng một số trong số chúng được sử dụng từ thời xa xưa trong y học cổ truyền để chữa bệnh. Hoa lan được xem như là “panda” giới thực vật vì sự hiếm có và lôi cuốn [1]. Western Ghats là một trong mười “điểm nóng đa dạng sinh học nhất thế giới” chứa hơn 300 loài phong lan dược liệu và cây cảnh. Aerides crispa Lindl., thường được gọi là Curled Aerides, là một trong những loài phong lan biểu sinh, đặc hữu của rừng nhiệt đới phía tây Ghats và được biết đến với chất dược tính và làm cây cảnh. Nhiều loài lan bao gồm A. crispa dễ bị tổn thương hoặc có nguy cơ tuyệt chủng do mất môi trường sống do thay đổi khí hậu hoặc thu hái cây để sử dụng trong y học cổ truyền địa phương, làm vườn và buôn bán hoa quốc gia/quốc tế [2]. Một tài liệu quan trọng còn ghi lại các nguyên nhân của sự hiếm có trong hoa lan, kiểm soát các dạng cá thể hiếm, nhân giống và bảo tồn chúng. Nhưng có ít cân nhắc về các chiến lược nhân giống để cải thiện các đặc điểm kinh tế và di truyền ở lan để bảo tồn và thương mại hóa tốt hơn [3, 4].

Các chương trình nhân giống thông thường rất khó thực hiện đối với hoa lan do khả năng nảy mầm kém của hạt và tốc độ tăng trưởng chậm trong điều kiện môi trường tự nhiên [5]. Do đó, đối với đột biến ở lan, việc kết hợp công nghệ nhân giống với nuôi cấy mô có thể là một phương pháp thành công vì chúng có nhiều lợi thế rõ ràng, chẳng hạn như (a) sử dụng hiệu quả các chất gây đột biến bằng hóa chất và vật lý ở liều thấp hơn; (b) tỷ lệ đột biến cao; và (c) đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả trong việc nhân giống vô tính in vitro của cá thể đột biến cung cấp nguyên liệu đầy đủ để sàng lọc thêm cũng như giảm sự hình thành chimera [6].

Người ta biết rằng việc sử dụng các bức xạ ion hóa như tia gamma và các hóa chất gây đột biến như ethyl methanesulfonate (EMS) có thể tạo ra các đột biến không thể đoán trước (ngẫu nhiên) không tồn tại trong tự nhiên [7]. Hóa chất gây đột biến khác là Colchicine, một tác nhân gây đa bội cũng có thể tạo đột biến bằng cách gây ra nguyên phân bất thường, thay đổi khối lượng của nhân, vv [8]. Khả năng phân lập các đột biến có lợi tăng lên khi dùng liều thấp và phổ đột biến rộng hơn và sự kết hợp của chúng được sử dụng [9]. Nó đã được ghi nhận rằng việc xử lý hạt giống bằng dung dịch colchicine trước khi xử lý đột biến vật lý khởi nguồn của quá trình đột biến hiếm gặp cũng như đột biến tạo kích thước lớn [10]. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc xử lý hạt giống bằng bức xạ gamma kết hợp với EMS gây ra đột biến vi mô ảnh hưởng đến các cá thể đa gen [11]. Ngoài ra, việc sử dụng công nghệ marker phân tử cung cấp một công cụ có thể hỗ trợ xác định các đột biến trong các nghiên cứu cảm ứng đột biến. Phân tích đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) là một phương pháp hiệu quả và kinh tế để đánh giá các biến thể di truyền cụ thể của đột biến. Tuy nhiên, cho đến nay, không có báo cáo nào nêu rõ việc sử dụng dạng đột biến để nhân giống Aerides. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá hiệu quả của cảm ứng đột biến in vitro thông qua colchicine, bức xạ gamma, EMS và sự kết hợp của chúng để cải thiện các đặc tính có giá trị kinh tế của A. crispa.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Vật liệu thực vật và thiết lập nuôi cấy in vitro

Quả A. crispa được rửa dưới vòi nước chảy và 5% (v/v) laboline, chất tẩy rửa dạng lỏng thương mại. Các quả này đã được khử trùng trong tủ cấy có luồng gió thổi bằng cách nhúng vào dung dịch clorua 0,5% w/v trong 2 phút sau đó rửa kỹ trong nước cất vô trùng. Sau đó, mẫu được khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 70% trong một phút và đốt cháy [12]. Vỏ quả đã khử trùng được tách ra bằng lưỡi phẫu thuật vô trùng và hạt của A. crispa được cấy trên Knudson C Basal Medium (KCBM) được bổ sung 15% nước dừa (coconut water – CW), 8,88 μM 6-benzyl amino purine (6-BAP) và Peptone 500 mg/L cho hạt nảy mầm và hình thành protocorm. Tất cả các hóa chất (phần nuôi cấy mô) được mua từ Duchefa, Hà Lan. Nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ 25 ± 2°C dưới ánh sáng huỳnh quang trắng tích hợp ở mật độ photon 30-50 μEM-2S-1 với độ ẩm tương đối 50-55% (RH) dưới chu kỳ chiếu sáng là 16h và 8h chu kỳ tối.

Cảm ứng đột biết in vitro

6000 protocorm 60 ngày thu được từ nuôi cấy hạt được xử lý bằng colchicine, EMS, bức xạ gamma riêng lẻ hoặc kết hợp để gây đột biến. Đối với nghiệm thức xử lý riêng lẻ, 15-20 protocorm đã được xử lý ba lần với nồng độ colchicine hoặc EMS khác nhau trong năm ngày hoặc tiếp xúc với bức xạ gamma 1 Gy đến 6 Gy. Các dung dịch vô trùng EMS (Sigma Aldrich, Mỹ) hoặc colchicine (Duchefa, Hà Lan) (0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4%) được thêm vào môi trường dinh dưỡng đã khử trùng (KCBM bổ sung 8,88 μM 6-BAP) chứa 8% agar, ở môi trường đó protocorms được nuôi trong năm ngày. Protocorms sau đó được rửa ba lần bằng nước vô trùng, làm khô trong giấy lọc vô trùng và được chuyển sang môi trường nhân chồi (KCBM bổ sung 8,88 μM 6-BAP) trong 30 ngày. Trong chiếu xạ, các chai nuôi cấy chứa protocorms được tiếp xúc với các liều khác nhau (1Gy-6Gy) của tia 60Co tại Viện Ung thư Kidwai, Bangalore, sau đó được chuyển sang các chai môi trường nhân nhanh. Đối với nghiệm thức xử lý kết hợp, protocorms được nuôi cấy trên môi trường chứa 100 hoán vị khác nhau của colchicine (0,025; 0,050; 0,100; 0,200 và 0,300%) và/hoặc phơi nhiễm với chiếu xạ gamma (1Gy-4Gy) và/hoặc EMS (0,025; 0,050; 0,100; 0,200 và 0,300%) như mô tả ở trên. Những protocorm này đã được cấy thêm trên môi trường nhân nhanh trong 30 ngày.

Chồi chồi sống tốt được chuyển qua cùng môi trường nuôi cấy trong 70 ngày để hình thành chiều chồi. Các chồi khỏe mạnh đã được cấy vào ½ KCBM bổ sung 2,45 μM indole-3-butyric acid (IBA), (Duchefa, Hà Lan) trong 35 ngày để hình thành rễ. Cây con cho thấy kiểu hình chồi/rễ khác biệt được nhân giống như các dòng biến thể để cung cấp nguyên liệu sàng lọc thứ cấp. Tần số đột biến được tính bằng tỷ lệ biến thể trên mỗi lần xử lý/ tổng số protocorm được xử lý X100. Lá biến thể đã được cắt và nuôi cấy trên KCBM bổ sung 6-BAP (8,88 μM) trong 60 ngày để có được protocorm like bodies (PLBs). Những PLB này đã được cấy vào KCBM bổ sung 6-BAP (8,88 M) và IBA (2,45 M) trong 120 ngày để có được chồi và rễ khỏe mạnh. Các dòng biến thể được trồng lớn lên trong 90 ngày trên các chậu nhựa nhỏ chứa than bùn: perlite: vermiculite (1: 1: 1 v/v) trong môi trường được kiểm soát (22±5°C, hai lần tưới, độ ẩm tương đối 60% (RH) và chế độ chiếu sáng 14 giờ sáng và 10 giờ tối) để quen môi trường. Các cây con sống được trồng trong chậu chứa hỗn hợp gạch nhuyễn: perlite: than củi (1: 1: 1 w/v) tại Orchidarium, Đại học Bangalore.

Sàng lọc sơ cấp các đột biến trong điều kiện in vitro

Ảnh hưởng của colchicine, bức xạ gamma, EMS và sự kết hợp của chúng chủ yếu được đánh giá trong điều kiện in vitro. Các protocorm còn sống được xử lý đột biến đã được đánh giá sau 30 ngày dựa trên chồi khỏe mạnh, không phát triển hoặc tử vong từ protocorms. Tỉ lệ sống được tính theo công thức: Tỉ lệ sống = số cây sống sót / tổng số PLBs X100. Chồi được nuôi cấy in vitro như cây con và được đánh giá sự thay đổi kiểu hình ở chồi và rễ sau 105 ngày. Kích thước của chồi và rễ được đo ngay trước khi chuyển ra vườn theo tỷ lệ milimet và/hoặc vernier[13].

Sàng lọc thứ cấp các đột biến trong điều kiện ex vitro

Cây khỏe mạnh 300 ngày tuổi đã thích nghi, được phân loại thành 52 dòng biến thể, được sàng lọc các biến thể di truyền và hình thái để xác định các dòng đột biến.

Đặc tính phân tử của đột biến

Phương pháp tách chiết DNA bộ gen thực vật Cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) đã được thực hiện để tách DNA bộ gen từ lá non của cây A. crispa đối chứng và đột biến. Tổng cộng có 28 mồi RAPD operon ngẫu nhiên đã được sử dụng để sàng lọc ban đầu ở cây đối chứng. Thể tích phản ứng PCR là 25 μL chứa 200 ng DNA genomic, 1 unit Taq polymerase, 4 μL GIRL dNTP, 2.5, μL buffer phản ứng 10X với 3,5 μL mồi ngẫu nhiên. Tất cả các hóa chất cần thiết cho PCR được mua từ Sigma Aldrich, Mỹ. Quá trình khuếch đại được thực hiện 40 chu kỳ với sự biến tính nhiệt ban đầu của DNA ở 94°C trong 3 phút. Chu kỳ nhiệt được thực hiện với các chế độ nhiệt độ sau: 94°C trong 90 giây, 30-40°C trong 2 phút – 30 giây (phụ thuộc vào mồi) và 72°C trong 3 phút. Bước cuối cùng được thực hiện ở 72°C trong 5 phút, sau đó làm mát đến 4°C để hoàn thành chương trình. Sự khuếch đại RAPD của đối chứng và các biến thể bằng cách sử dụng 11 mồi RAPD operon đã được nghiên cứu thành công dựa trên cường độ và kích thước của dải. Cấu hình RAPD được lặp lại ba lần để xác nhận độ tái lập của nó.

Mỗi băng RAPD thông tin được ghi độc lập: 1 khi xuất hiện và 0 khi không xuất hiện. Tỷ lệ đa hình được tính bằng tỷ lệ của các dải đa hình trên tổng số dải. Các band biểu thị chỉ cho một mẫu được tính là Band duy nhất. Các dải phổ biến trong tất cả các mẫu được coi là các dải đơn hình. Phân tích cụm các dải đa hình và duy nhất được thực hiện trên ma trận khoảng cách Euclide với trung bình số học phương pháp nhóm không cân bằng (UPGMA) bằng cách sử dụng Soft Stat Mode, phần mềm năm 1993 để phân tích khoảng cách di truyền giữa các dòng biến thể có sự khác biệt về hình thái.

Đặc điểm hình thái của đột biến

Sự khác biệt so sánh trong các thông số hình thái, chẳng hạn như chiều cao cây và chiều dài và chiều rộng của lá, được đo bằng thang đo milimet. Số lượng lá trên mỗi cây, hình dạng lá và phổ diệp lục của cây đối chứng và cây đột biến được đánh giá bằng quan sát bằng mắt thường. Mật độ khí khổng là tổng số khí khổng hiện diện trên một milimet mô và được tính bằng kính hiển vi quang học. Nghiên cứu hình thái này được thực hiện ba lần cho 8 – 10 bản sao thực vật.

Ước tính hàm lượng chất diệp lục và carotenoid

Tổng hàm lượng chất diệp lục và caroten được chiết xuất bằng phương pháp chuẩn [14]. Tổng nồng độ diệp lục và caroten được tính toán bằng phương trình Porra (2002) và phương trình Lichtenthaler & Welburn (1983), và được tính theo trọng lượng tươi (FW) [14,15]: tổng diệp lục = 17,76 (A646) + 7,34 (A663) ; carotenoid = {[1000 A470 – 3.27 Chl a] – [104 Chl b]} / 227; trong đó A = độ hấp thụ.

Phân tích thống kê

Các thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên và ba lần lặp lại trong điều kiện vật lý giống hệt nhau. Dữ liệu thu được từ các kết quả của tất cả các thí nghiệm đã được sử dụng phương pháp ANalysis Of VAriance (ANOVA) một chiều để xác định sự khác biệt giữa các nghiệm thức và Độ lệch chuẩn (SD) để xác định các biến thể trong các nghiệm thức. Các giá trị trung bình được so sánh bằng cách sử dụng phương pháp Duncan [16]. Phần mềm thống kê SPSS 15.0 (2006) được sử dụng để xác định ANOVA và SD.

Kết quả

Cảm ứng in vitro đột biến

Nghiệm thức Protocorm (Hình 1a) với các nồng độ khác nhau (0,025 – 0,03%) của colchicine và EMS; liều khác nhau (1 – 4 Gy) của bức xạ gamma; và 27 sự kết hợp của colchicine (0,025; 0,05 và 0,1%), bức xạ gamma (1, 2 và 3 Gy) với EMS (0,025; 0,05 và 0,1%) gây ra sưng phồng protocorm và bắt đầu hình thành búp chồi, sau 10 – 20 ngày (Hình 1 b và c).

Những protocorm được xử lý này đã phát triển thành chồi khỏe mạnh, với tần số sống sót 40-60%. Trong số tất cả các nghiệm thức xử lý, tia Gamma (2Gy) và EMS (0,05%) cho thấy là liều LD50% cho từng nghiệm thức xử lý, trong khi kết hợp 0,05% Colchicine với 0,025% EMS và 0,025% colchicine với bức xạ gamma 2Gy cho thấy các liều LD ở các nghiệm thức xử lý kết hợp. Colchicine và EMS (0,025% mỗi loại) với tia gamma 1Gy đã được ghi nhận liều LD50 cho sự kết hợp của ba đột biến. Xử lý bằng các liều colchicines đơn lẻ hoặc kết hợp với liều cao hơn (0,4%), phóng xạ gamma (5-6Gy) và EMS (0,4%) dẫn đến hiện tượng nâu của protocorms hoặc chồi hình thành từ đầu apical (Hình 1d) co nhỏ lại và tử vong sau 20 – 30 ngày (Hình 1e). Tần số sống sót của protocorms được xử lý với liều cao hơn dao động từ 0-10%. Tổng cộng, 2500 cây giống in vitro thu được từ xử lý đột biến. Protocorm không được xử lý đã được phát triển với tỷ lệ sống sót 92 ± 8% và tần số đột biến 0,32 ± 0,03%. Tần số đột biến tối thiểu này có thể được tìm thấy do biến đổi biểu sinh. Tần số đột biến của cây giống in vitro khỏe mạnh được phát triển bằng nghiệm thức xử lý đột biến không thay đổi theo cách phụ thuộc liều. Tần số đột biến tối đa (86,63 ± 4,51%) với tỷ lệ sống sót 52 ± 2% đã được quan sát khi xử lý kết hợp 0,025% colchicine, bức xạ gamma 1-Gy và 0,025% EMS (Bảng 1). Tổng cộng, 206 cây con in vitro khỏe mạnh với kiểu hình đa dạng đã thu được từ 35 nghiệm thức xử lý đột biến.


Hình 1 – Ảnh hưởng của nghiệm thức đột biến ở protocorms in vitro của A. crispa. (a) Protocorm tăng trưởng in vitro 60 ngày tuổi; (b) Protocorm sưng lên sau 10 ngày xử lý với 0.05% colchicine; (c) Sự hình thành chồi khỏe mạnh sau 20 ngày của nghiệm thức 0.05 % colchicine; (d) Protocorm hóa nâu từ phần dưới chồi sau 25 ngày xử lý với 0.05 % colchicine và 0.1 % EMS; và (e) Lá mầm co lại và chết sau 30 ngày xử lý với 0.3% EMS.



Bảng 1 – Ảnh hưởng của các liều gây đột biến khác nhau trong cảm ứng đột biến in vitro

Sàng lọc sơ cấp các biến thể

Cây con khỏe mạnh đã được xem xét để xác định biến thể dựa trên sự thay đổi trong kiểu hình chồi và rễ. Sàng lọc cây con bằng mắt thường phân biệt 52 dòng kiểu hình đột biến trong điều kiện nuôi cấy. Kết quả cho thấy các biến thể chính về hình dạng, màu sắc, sọc trắng, độ dày, chiều dài và chiều rộng của lá cũng như chiều dài và độ dày của rễ trong số 52 dòng biến thể in vitro. Các sọc trắng nổi bật đã được quan sát trên lá của biến thể ACM2 (Hình 2b), trong khi các sọc màu xanh nhạt được quan sát trên các biến thể ACM4, ACM7, ACM8 và ACM10 (Hình 2 c – f). Các biến thể trong hình dạng lá, chiều dài lá, chiều dài rễ và độ dày của rễ đã được chú ý trong số nhiều biến thể (Hình 2 a – p).

Chồi dài nhất (3,40 ± 0,09 cm) được quan sát thấy trong ACM49, một biến thể được phát triển bằng cách sử dụng kết hợp xử lý 0,025% colchicine, bức xạ gamma 1 Gy và 0,025% EMS. Ngược lại, chồi ngắn nhất (0,72 ± 0,03 cm) được quan sát thấy trong biến thể ACM10, được phát triển bằng cách chiếu xạ gamma (3 Gy) (Bảng 1). Nghiệm thức xử lý gây đột biến cho thấy ảnh hưởng phức tạp đến kiểu hình gốc. Chiều dài rễ của cây con in vitro dao động trong khoảng 0,65 ± 0,13 cm và 2,30 ± 0,21 cm trong số các biến thể ACM7 và ACM13, được phát triển bằng cách xử lý protocorms với bức xạ gamma 1 Gy và 0,1% colchicine, tương ứng (Bảng 1; Hình 2) . Độ dài chồi và rễ của các biến thể không tương quan.

Sàng lọc thứ cấp các đột biến trong điều kiện ex vitro

Trong 52 dòng biến thể in vitro, có sự bất thường về hình thái so với các cây đối chứng, đã được dưỡng cứng cáp, thích nghi và duy trì trong Orchidarium, với tần suất sống 70-80%. Những dòng biến thể và cây đối chứng được trồng trong điều kiện vật lý giống hệt nhau. Một số thuộc tính mong muốn, chẳng hạn như sự gia tăng chiều cao của cây và số lượng lá trên mỗi cây đã được quan sát trong tất cả các dòng biến thể so với các cây đối chứng. Một hoặc một vài biến thể đáng chú ý, chẳng hạn như kích thước lá, hình dạng lá, phổ diệp lục của lá [maculation (điểm mà diệp lục và/hoặc carotene đã bị phá hủy), striata (dải dọc màu trắng xen kẽ với dải màu xanh lá cây) và viridis (màu xanh nhạt)], và mật độ lỗ khí được chú ý giữa các dòng biến thể và cây đối chứng. Chiều dài và độ dày của rễ không thay đổi nổi bật giữa hầu hết các biến thể và cây đối chứng. Những dòng biến thể này được so sánh về sự đa dạng di truyền của chúng trước khi xác định và xác nhận các dòng đột biến hình thái.

Đặc tính phân tử của các biến thể

DNA được tách chiết từ ​​lá non của mẫu đối chứng và các biến thể. DNA hàm lượng 0,2 – 0,5 mg/g trọng lượng tươi. Tất cả các mẫu DNA cho thấy tỷ lệ A260/A280 trung bình giữa 1,46 và 1,76, cho thấy các mẫu DNA phù hợp để phân tích RAPD và lưu trữ lâu dài. Trong số 28 mồi RAPD của Operon được sử dụng để sàng lọc kiểm soát ban đầu, 11 được chọn để phân tích đa dạng di truyền dựa trên khả năng tái tạo, độ mạnh của khuếch đại và khả năng ghi điểm của các dải giữa các đối chứng và đột biến. Quá trình khuếch đại DNA của các dòng biến thể và đối chứng cho thấy năm đoạn mồi tạo ra các dải đơn hình cho tất cả các dòng biến thể, trong khi ba đoạn mồi OPA-12, OPD-07 và OPG-09 cho thấy 63, 96 và 162 dải đa hình và 7, 4, và 2 dải duy nhất, tương ứng (Hình 3 a, c; Bảng 2) trong số các dòng điều khiển và 15 dòng biến thể. Do đó, trong số 52 dòng biến thể được nghiên cứu, cấu hình RAPD đã xác nhận sự biến đổi di truyền ở 15 dòng biến thể hình thái của A. crispa: ACM2, ACM4, ACM7, ACM8, ACM10, ACM11, ACM13, ACM17, ACM20, ACM25, ACM29, ACM và ACM52 (Hình 3).


Hình 2 – Gây đột biến in vitro của A.crispa: định danh các dòng đột biến thông qua sự khác biệt về hình thái. (a) Đối chứng; (b) ACM2: các dải trắng; (c) ACM4: thiếu chlorophyll; (d) ACM7: rễ dày hơn; € ACM8: rễ dày và dài hơn; (f) ACM10: phát triển ít; (g, h, I, j) ACM11, ACM13, ACM17, ACM20: chồi bất thường và hình dạng và chiều dài rễ bất thường; (k, l) ACM25, ACM29: chồi bất thường; (m) ACM39: lá rộng và dài; (n) ACM41: lá rộng và dày; và (o, p) ACM49, ACM52: tăng trưởng nhanh- lá dài và rộng hơn.


Hình 3 – Thông tin RAPD và biến dị hình thái trong A.crispa sử dụng primer operon: (a) OPA-12; (b) OPD-07; và (C) OPG-09. [L – Thang chuẩn; C – đối chứng; 1-15 đột biến: ACM2, ACM4, ACM7, ACM8, ACM10, ACM11, ACM13, ACM17, ACM20, ACM25, ACM29, ACM39, ACM41, ACM49, ACM52].


Bảng 3 – Đặc điểm của 15 dòng đột biến của A.crispa cho khác biệt hình thái và đặc điểm khí khổng

Các kết quả được mô tả rõ ràng trong dendrogram, được xây dựng với dữ liệu kết hợp của các đoạn mồi OPA-12, OPD-07 và OPG-09 (Hình 4). Phân tích dendrogram, được thực hiện bằng phương pháp UPGMA, hiển thị cụm quần thể đột biến có phạm vi đa hình di truyền vừa phải, trong đó khoảng cách di truyền thay đổi từ 2,4 đến 5,1.

Tham khảo giá các hóa chất đột biến Lan: EMS, 2-Aminopurine, Colchicine

Đặc điểm của các đột biến dựa trên hình thái, khí khổng và sắc tố

Kiểu phân cụm tốt ứng với sự thay đổi về hình thái, mật độ khí khổng và hàm lượng sắc tố giữa các đột biến và đối chứng (Bảng 3; Hình 5). Hình thái của lá và cây đối chứng được minh họa trong Hình 5 a và b. Phân tích cụm tách các dòng đột biến ACM25 và ACM29 ra khỏi tầm kiểm soát và các đột biến khác. Các dòng đột biến này cho thấy mật độ khí khổng cao hơn (lần lượt là 122 và 98%) so với kiểm soát ngoài các biến đổi hình thái (Bảng 3; Hình 5 c và d). Các dòng đột biến ACM11 và ACM13, được tiến hóa bằng cách xử lý các protocorm bằng colchicine: 0,05 và 0,1%, được ghi nhận là ít nhất về khoảng cách di truyền với nhau (2.4) trong số tất cả các dòng đột biến (Hình 4). Chúng có lá hình ngọn giáo dài hơn (4,24 ± 0,41 cm và 4,02 ± 0,09 cm) (Hình 5 e và f) so với các lá nhỏ đối chứng. Các lá này có thể được phân biệt với nhau dựa trên các biến thể trong tổng hàm lượng chất diệp lục (Hình 6). Dendrogram (Hình 4) cho thấy sự khác biệt tối đa (4,65) trong các dòng đột biến ACM17 và ACM20, có kích thước lớn hơn về mặt hình thái so với đối chứng nhưng có cùng hình dạng lá. Chúng không giống nhau vì hàm lượng caroten cực cao trong ACM20 (Hình 5 g – i; Hình 6).


Hình 4 – Dendrogram minh họa mối quan hệ di truyền ở đối chứng và 15 đột biến hình thái của a.crisspa sử dụng phương pháp UPGMA để phân nhóm.

Hình 5 – Đặc điểm hình thái của cảm ứng đột biến in vitro của A.crispa. (a) lá đối chứng; (b) cây đối chứng; (c) dòng đột biến ACM25; (d) ACM29; (e) ACM11 : lá hình ngọn giáo, lá mỏng dài và ít chlorophyll; (f) ACM13: lá hình ngọn giáo, mỏng, dài với chlorophyll cao; (g) ACM17: lá dài có diệp lục cao; (h, i) ACM20: lá dài, lõm với caroten cao; (j) ACM2: lá dài, hình ngọn giáo, straita; (k) ACM4: lá chét dài, dày hơn; (l) ACM7: lá dài, nhô ra; (m) ACM8: lá dài, thuôn, sáp, Viridis; (n, o) ACM10: lá ngắn, thuôn, lá Viridis; (p) ACM39: lá dài, thuôn và rộng; (q) ACM41: lá dài, thuôn, dày và rộng hơn; (r) ACM49: cây dài hơn với số lượng lá dài hơn; và (s) ACM52: cây dài nhất với số lượng lá rộng hơn

Đặc tính hình thái cho thấy năm dòng đột biến (ACM2, ACM4, ACM7, ACM8 và ACM10), đã phát triển từ các nghiệm thức xử lý liều của bức xạ gamma và EMS, cho thấy hình dạng lá thay đổi, kích thước, số lượng hoặc nhiều thay đổi hơn so với đối chứng. Những dòng đột biến này có diệp lục và caroten ít hơn so với đối chứng. Lá của ACM2 thể hiện hình dạng lá nhỏ có dây buộc với phổ diệp lục (sọc trắng) (Hình 5j). Lá ACM4 và ACM7 có phổ maculata (đốm thiếu diệp lục và / hoặc caroten) nhưng được phóng to tương tự như đối chứng (Hình 5 k và l). Lá ACM8 và ACM10 có hình dạng thuôn đáng chú ý với phổ diệp lục viridis (màu xanh nhạt) và kích thước lá có thể phân biệt rõ ràng Hình.

Các dòng ACM39 và ACM41 có lá thuôn dài, rộng và dày hơn rõ rệt, trong khi các dòng ACM41 có các lá sáp có sắc tố không đồng đều rõ rệt (Hình 5 p và q). Sự tăng trưởng thực vật bất thường (tăng đáng kể kích thước cây) đã xảy ra giữa các dòng ACM49 và ACM52, không giống như đối chứng. Trong số các đột biến, ACM52 hiển thị chiều cao và số lượng lá tối đa, trong khi ACM49 cho thấy chiều dài lá tối đa (Hình 5 r và s). Các kết quả nghiên cứu đã xác nhận rằng sự phát triển của thực vật, cấu trúc lá và các gen sản xuất hoặc điều hòa sắc tố và sắc tố bị ảnh hưởng chủ yếu bởi các đột biến do in vitro.

Thảo luận

Tần số đột biến phụ thuộc vào vị trí gen trong bộ gen và điều kiện xử lý trong quá trình gây đột biến [17]; do đó, việc lựa chọn một đột biến và liều tối ưu của nó là một bước quan trọng trong các chương trình nhân giống đột biến nhân tạo. Trong nghiên cứu này, nồng độ cực thấp của colchicine và EMS (0,025 – 0,3%) cũng như liều bức xạ gamma (1 – 4 Gy) gây ra các biến đổi trong protocorms được xử lý, trong khi đó liều cao hơn (0,4% colchicine và EMS; 5 và 6 Gy của bức xạ gamma) gây phá hủy hoặc tử vong của các protocorm được xử lý ở A. crispa. Liều tương tự có hiệu quả đối với cảm ứng đột biến in vitroLilium longiflorumAsteracantha longifolia [18, 19]. Trong nghiên cứu này, sự kết hợp của các nghiệm thức xử lý đột biến để gây đột biến in vitro đã được sử dụng theo trình tự: colchicine, bức xạ gamma và EMS. Xử lý bắt đầu với colchicine vì ngoài việc cải thiện tốc độ tăng trưởng, nồng độ colchicine thấp giúp tăng cường tổng hợp hormone tăng trưởng thực vật và thay đổi hoạt động cụ thể của các enzyme, làm giảm tỷ lệ chết [10]. Hơn nữa, xử lý chiếu xạ gamma kích thích mạng lưới tín hiệu nội tiết tố kiểm soát sự hấp thu của EMS dẫn đến ít sự kiềm hóa trong phân tử cao phân tử và giảm tần số quang sai nguyên phân và giảm phân [20]. Trong nghiên cứu này, hoán vị liều thấp của đột biến đã được tìm thấy hiệu quả hơn so với liều riêng lẻ để tạo ra các đột biến ngẫu nhiên ở tần số cao hơn. Tần số đột biến ngẫu nhiên độc lập với liều có thể được ghi nhận do quang sai không thường xuyên của nhiễm sắc thể, nhiễm sắc chất hoặc subchromatid; thay đổi số lượng nhiễm sắc thể; ức chế phân chia tế bào; và cảm ứng của hoạt động phân bào [8, 21].

Trong nghiên cứu này, xử lý protocorm với liều thấp hóa chất đột biến colchicine ; EMS và bức xạ gamma cho thấy sự phát triển bất thường của chồi và/hoặc rễ, hình dạng lá nhỏ và phổ diệp lục giữa các cây trồng in vitro bị đột biến. Tác dụng kích thích tương tự ở liều bức xạ gamma thấp đã được ghi nhận trong rau diếp [21]. Tác dụng hiệp đồng của đột biến vật lý kết hợp với đột biến hóa học được nghiên cứu toàn diện trên các loại cây trồng khác nhau [9, 11]. Các kiểu hình đột biến của sự kiểm soát, có thể chiếm các biến thể somaclonal là do stress in vitro [22, 23]. Mengli et al. [17] quan sát thấy tần số đột biến tương tự trong đối chứng.

Đặc điểm hình thái là sản phẩm của các tương tác gen và môi trường. Vì vậy, các đột biến không được xác định ở mức độ biến đổi di truyền thực tế [22-24]. Biến dị di truyền giữa các biến thể hình thái trong ống nghiệm đã được xác nhận bằng cách sử dụng kỹ thuật đánh dấu phân tử (RAPD), trong nghiên cứu này. Trong số 52 dòng biến thể in vitro dựa trên sự biến đổi hình thái, chỉ có 15 dòng đột biến có thể được thiết lập trên cơ sở đa dạng di truyền. Điều này có thể là do hầu hết các biến thể hình thái là do đột biến soma hoặc biểu sinh và có thể hiện diện ở vùng không mã hóa của bộ gen và ít hơn nhưng các biến thể tòn tại lâu dài xảy ra ở các vùng mã hóa [25]. Mô hình phân cụm của các dòng đột biến inter se cũng tốt tương ứng với các biến đổi hình thái, khí khổng và sắc tố trong nghiên cứu này. Phân tích dendrogram tương tự bằng phương pháp UPGMA cho thấy sự phân nhóm của đối chứng và đột biến EMS ở Asteracantha [26], các chất phóng xạ của Chrysanthemum inter se [27] và các quần thể gần gũi về mặt hình thái, địa lý và sinh thái của các loài Rhynchostylis retusa [28].

Borzouei và cộng sự [29] giả thuyết rằng chiếu xạ thấp gây ra kích thích tăng trưởng bằng cách thay đổi mạng lưới tín hiệu nội tiết tố trong tế bào thực vật hoặc bằng cách tăng khả năng chống oxy hóa của các tế bào để vượt qua các yếu tố stress một cách dễ dàng. Những lý do này có thể chịu trách nhiệm cho sự tăng trưởng nhanh hơn của thực vật trong các dòng đột biến so với đối chứng. Kiểu hình lá là đặc điểm nổi bật nhất và dễ dàng phát hiện trong cảm ứng gây đột biến. Liều bức xạ thấp của EMS và gamma, riêng lẻ và kết hợp, gây đột biến hình dạng lá và/hoặc biến đổi về chiều dài và chiều rộng của lá. Hình dạng lá lõm, thuôn và hình ngọn giáo đã được ghi nhận trong các nghiệm thức xử lý liều khác nhau của bức xạ EMS và gamma. Lá đột biến dài hơn lá đối chứng, ngoại trừ ở liều bức xạ gamma tương đối cao (3 Gy). Ngoài ra, chiều rộng lá bất thường đã được chú ý sau khi xử lý khác nhau. Cấu trúc lá và đột biến hình dạng thông qua bức xạ gamma cũng đã được báo cáo trong nhiều loại cây trồng như lúa mì và đậu tương [29, 30]. Những phát hiện hiện tại cho thấy tác dụng khác biệt của các đột biến vật lý và hóa học trong việc gây ra các biến đổi diệp lục tố, chẳng hạn như maculation và straita, sau khi xử lý bằng EMS và phổ maculata và viridis sau khi xử lý bằng tia gamma. Tuy nhiên, không quan sát thấy ảnh hưởng sau khi xử lý kết hợp. Sự chiếm ưu thế của các đột biến khác nhau trong nghiên cứu hiện tại có thể do sự tham gia của các gen đa gen trong sự hình thành diệp lục [31].

Colchicine cảm ứng hiệu quả tốc độ tăng trưởng ở mức độ tế bào học, di truyền, sinh hóa, sinh lý và hình thái và số lượng sắc tố trong các kiểu gen khác nhau [32, 33]. Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức xử lý với colchicine và sự kết hợp colchicine với bức xạ gamma và/hoặc EMS không cho thấy bất kỳ sự thay đổi diệp lục nào; tuy nhiên, tăng nồng độ sắc tố và các thông số tăng trưởng, chẳng hạn như chiều cao cây, số lượng lá và chiều dài lá, đã được ghi nhận. Sự thay đổi có lợi tương tự đối với sự tăng trưởng, sắc tố và các sản phẩm dầu dễ bay hơi của các mẫu Melalenea amillaris smith đã được ghi nhận do các nghiệm thức xử lý phối hợp gamma và colchicine khác nhau [34]. Sắc tố quang hợp được gọi là chỉ số thích hợp của đột biến, stress và trạng thái dinh dưỡng [35]. Sự phân bố liều độc lập không thường xuyên của chất diệp lục và caroten, trong các đột biến của nghiên cứu hiện tại, được quan sát tương tự như các báo cáo trong Triticum aestivum L. và Capsicum annuum L [29, 36]. Một số báo cáo cho thấy đột biến điểm trong một gen của một con đường truyền tín hiệu có thể gây ra sự thay đổi cụ thể trong mật độ và kích thước lỗ khí [37, 38]. Điều này có thể giải thích sự gia tăng bất thường về mật độ khí khổng và sự thay đổi rõ rệt về hình thái lá của các đột biến ACM25 và ACM29.

Kết luận

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã đánh giá hiệu quả cảm ứng đột biến in vitro thông qua colchicine, bức xạ gamma, EMS (riêng lẻ và kết hợp) có ý nghĩa trong cải thiện đặc điểm kinh tế của 15 dòng đột biến của A. crispa. Sự kết hợp của công nghệ đột biến trong điều kiện in vitro và phương pháp RAPD đã chứng minh ở A. crispa, thể hiện sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng, hình dạng lá, chiều dài lá, chiều rộng, độ diệp lục, mật độ lỗ khí và/hoặc hàm lượng sắc tố. Hóa chất đột biến hoa Lan sử dụng liều thấp của Colchicine, EMS và tia bức xạ gamma đã chứng minh cho thấy hiệu quả đột biến trong nuôi cấy in vitro.

Lời cảm ơn

Học bổng nghiên cứu trẻ do Hội đồng nghiên cứu khoa học và công nghiệp (CSIR), New Delhi, Ấn Độ cung cấp cho một trong những tác giả, Tiến sĩ Deepti Srivastava rất biết ơn. Đồng tác giả Tiến sĩ MC Gayatri rất biết ơn Ủy ban Tài trợ Đại học (UGC) đã cung cấp Học bổng Khoa UGC-BSR. Các tác giả báo cáo không có xung đột lợi ích.

Tham khảo những biến đổi trong vật chất di truyền

Trâm Anh
SBC SCIENTIFIC
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com


Facebook Comments

One Reply to “Hóa chất gây đột biến hoa Phong Lan”

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *