Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô hay vi nhân giống thực vật là cách nhanh và hiệu quả nhằm nhân giống số lượng lớn. Tùy theo từng loài cây, và các vị trí lấy mẫu mà ta chọn môi trường nuôi cấy mô cho phù hợp, nhằm tối ưu hóa sự phát triển của chúng.

Công thức môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể có ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Có nhiều công thức khác nhau đã được phát triển trong nhiều năm cho vô số loài thực vật, nhưng một số ít được sử dụng phổ biến hơn cho hầu hết quá trình nuôi cấy mô thực vật.

Các loại môi trường

Môi trường Murashige & Skoog (1962) là môi trường thông dụng nhất được sử dụng cho tới nay. Cũng có nhiều môi trường hiệu quả khác được sử dụng như White (1963), “Gamborg B5” của Gamborg et. al. (1968), Schenk và Hildebrandt (1972), Nitsch và Nitsch (1969), và “Woody Plant Medium” của Lloyd và McCown (1980). Các công thức môi trường này có thể được làm từ dung dịch gốc lỏng của muối và vitamin hoặc được mua dưới dạng bột trộn sẵn.

Các thành phần trong môi trường nuôi cấy

Có nhiều thành phần và chất phụ gia có thể được sử dụng trong môi trường vi nhân giống thực vật, nhưng hầu hết có thể được xếp thành tám loại: nước, muối dinh dưỡng (vi lượng và đa lượng), vitamin, axit amin, carbohydrate, chất tạo gel, chất điều hòa sinh trưởng (hormone), và các chất bổ sung hữu cơ khác. Sau đây là tóm tắt của từng loại thành phần:

Nước: Môi trường nuôi cấy thực vật được chuẩn bị tới 90% là nước. Điều quan trọng là phải sử dụng nước sạch để không có khoáng chất hoặc các tạp chất khác ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Điều này được thực hiện bằng cách chưng cất hoặc thẩm thấu ngược hoặc đơn giản mua nước cất để sử dụng.
Muối dinh dưỡng: Muối thường được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng, cần thiết cho sự phát triển của cây. Các chất dinh dưỡng đa lượng được yêu cầu với số lượng lớn hơn (1-60 mM) và bao gồm nitơ, phốt pho, kali, canxi, magiê và lưu huỳnh.

Các vi chất dinh dưỡng được yêu cầu với số lượng nhỏ hơn (0,1-100 µM) và bao gồm sắt, mangan, kẽm, bo, đồng, molypden, coban và iốt. Natri và clo cũng được thêm vào một số môi trường nhưng không được coi là cần thiết cho sự phát triển của thực vật.

Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thường được bổ sung vào môi trường dưới dạng muối ở dạng dễ sử dụng hơn cho cây trồng. Ví dụ về muối dinh dưỡng bao gồm canxi nitrat, kali clorua và magie sunfat. Sắt và kẽm đôi khi được bổ sung ở dạng chelated để hỗ trợ sự sẵn có và tránh sự kết tủa của các nguyên tố đó. Các chất tạo chelat phổ biến bao gồm EDTA hoặc EDDHA.
Vitamin: Cây trồng trong ống nghiệm thường thiếu khả năng tổng hợp vitamin, ngược lại với cây trồng trong đất hoặc giá thể khác.

Nhiều loại vitamin khác nhau được thêm vào dưới dạng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật để cung cấp các hợp chất có tác dụng kích thích các chức năng trao đổi chất nhất định. Các chất bổ sung vitamin thường được sử dụng với tỷ lệ 0,1-10 mg / L và bao gồm thiamine, axit nicotinic, pyridoxine và myo-inositol.
Axit amin: Một số axit amin nhất định được thêm vào môi trường nuôi cấy mô thực vật và có thể có lợi cho sự phát triển của tế bào thực vật vì chúng là nguồn nitơ sẵn có mà đôi khi cây trồng dễ hấp thụ hơn so với nguồn vô cơ. Hỗn hợp axit amin, chẳng hạn như casein hydrolysate, hoặc các axit amin đơn lẻ, chẳng hạn như glycine, glutamine hoặc adenin, có thể được thêm vào môi trường với các tỷ lệ khác nhau, từ 2-1000 mg / L.
Carbohydrate- Hầu hết các cây trồng trong ống nghiệm không có khả năng tự sản sinh ra carbohydrate từ ánh sáng, nước và carbon dioxide như trong thế giới tự nhiên. Nguồn carbohydrate phải được cung cấp cho môi trường để cây phát triển. Nguồn carbohydrate được sử dụng phổ biến nhất là sucrose, nhưng glucose, fructose và maltose cũng được sử dụng với tỷ lệ 20-30 g / L. Ảnh hưởng của nguồn và lượng carbohydrate được sử dụng trong môi trường thay đổi tùy theo các loài thực vật khác nhau.
Chất tạo đặc ( gelling agents): Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường được bổ sung chất tạo gel hoặc hỗn hợp một số chất. Mục đích của chất tạo gel là cung cấp hỗ trợ vật lý cho cây đang được nuôi cấy.

Agar (có nguồn gốc từ tảo đỏ Gracilaria) là một chất tạo gel thường xuyên, nhưng gellan gum (có nguồn gốc từ vi khuẩn Sphingomonas, có nhiều tên khác như gelrite, phytagel) cũng được sử dụng một mình hoặc kết hợp với thạch.

Agarose (chiết xuất từ một số loại rong biển đỏ) được sử dụng ở mức độ thấp hơn, đặc biệt là để nuôi cấy phấn hoa. Các loài thực vật khác nhau có thể phát triển tốt hơn bằng cách sử dụng một chất tạo gel nhất định hoặc hỗn hợp nhiều loại, vì vậy nên thử nghiệm trước. Trong một số trường hợp, phản ứng của cây trồng có thể khác nhau tùy thuộc vào nhà sản xuất hoặc độ tinh khiết của chất tạo gel. Nếu không sử dụng chất tạo gel, chẳng hạn như đối với nuôi cấy tế bào huyền phù, hoặc lắc liên tục mẫu cấy trên máy lắc.
Chất điều hòa sinh trưởng – Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR- plant growth regulator) để đạt được các đặc tính sinh trưởng mong muốn cho loài thực vật / giống cây trồng mục tiêu.

Có bốn nhóm chính của PGR: auxin, cytokinin, gibberellins và axit abscisic. Auxin và cytokinin được sử dụng nhiều nhất và thường được áp dụng kết hợp với nhau. Auxin có xu hướng kích thích sự hình thành và phát triển của rễ và mô sẹo, trong khi các cytokinin có xu hướng thích sự hình thành và phát triển của chồi nách và chồi bất định. Axit gibberellic được sử dụng để kích thích sự kéo dài chồi và axit abscisic có thể thúc đẩy và tăng chất lượng tổng thể của phôi soma.

Các auxin phổ biến nhất được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật bao gồm axit indoleacetic (IAA), axit indolebutyric (IBA), axit naphthaleneacetic (NAA) và axit 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D) và được sử dụng với tỷ lệ 0,01 -10 mg / L. Các cytokinin thường được sử dụng bao gồm benzyladenine (BA), kinetin và zeatin, được sử dụng trong khoảng 0,1-10 mg / L.

Hầu hết hormone có thể được hấp tiệt trùng cùng với các thành phần môi trường khác, tuy nhiên nếu cần nồng độ tới hạn, thì nên khử trùng bộ lọc và bổ sung sau khi hấp tiệt trùng.
Vì lượng PGR ở kích thước nhỏ được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, các dung dịch gốc (thường có nồng độ xác định là X mg / mL) được sử dụng để hỗ trợ việc đo lường lượng mong muốn một cách thuận tiện và chính xác.

Hầu hết PGR phải được hòa tan vào dung môi thích hợp (như etanol, DMSO, natri hydroxit, axit clohydric, v.v.) trước khi pha loãng để có nồng độ cuối cùng của dung dịch gốc. Dung dịch gốc nên được bảo quản trong tủ lạnh hoặc đông lạnh.
Các chất bổ sung hữu cơ và chất chống oxy hóa khác- Có rất nhiều hợp chất hữu cơ khác có thể có lợi cho sự phát triển của thực vật trong nuôi cấy mô. Chúng có thể bao gồm nước cốt dừa, casein hydrolysate, chiết xuất mạch nha (malt extract) và than hoạt tính (AC).

Than hoạt tính đôi khi được thêm vào môi trường nuôi cấy thực vật, nơi các mô thực vật tạo ra các hợp chất phenolic bị oxy hóa hoặc các tạp chất khác có thể trở nên độc hại theo thời gian. Thêm AC vào môi trường với tỷ lệ 0,5-5 g / L có thể giúp hấp phụ các hợp chất độc hại mà nếu không sẽ có tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng.

Chất chống oxy hóa và các hợp chất giống như chất chống oxy hóa đôi khi được thêm vào như một chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các loại oxy phản ứng (ROS) có thể gây ra tổn thương oxy hóa cho các mô thực vật. Axit ascorbic, axit xitric, glutathione (dạng giảm), axit lipoic, glycine betaine, D-tocopherol (vitamin E), axit salicylic và polyvinylpyrrolidone (PVP) đều được chứng minh là có khả năng ức chế sự hình thành ROS, nhưng tác dụng của chúng khác nhau rộng rãi giữa các loài thực vật khác nhau.

Tại Phòng thí nghiệm Quốc gia về Bảo tồn Tài nguyên Di truyền, ở Fort Collins, các vi cành và chồi ngọn CO, Vitis được xử lý bằng hỗn hợp gồm 1 mM axit ascorbic, 1 mM glutathione (dạng giảm) và 0,1 mM axit salicylic trong tiền xử lý và phương tiện tiền nuôi cấy, tương ứng (Bettoni et al. 2019). Phương pháp điều trị này đã được chứng minh là cải thiện đáng kể sự mọc lại của chồi sau quá trình bảo quản lạnh, có thể là do tác dụng chống oxy hóa của nó.

Tương tự, Uchendu, et al. (2010) phát hiện ra rằng việc thêm glutathione (giảm), axit lipoic, hoặc glycine betaine vào các bước khác nhau của quá trình bảo quản lạnh đã làm tăng đáng kể sự phát triển lại của các chồi được bảo quản lạnh.